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本试剂盒基于GST琼脂糖纯化树脂，用于分离纯化带有GST标签的可溶性重组蛋白，而溶解于高浓度变性剂的包涵体蛋白不能用这种介质纯化。

本试剂盒中的GST琼脂糖纯化树脂是以4%琼脂糖凝胶为基质，通过10碳连接，用化学方法共价结合了还原型谷胱甘肽制作而成。GST琼脂糖纯化树脂与谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签结合力高，可纯化含GST标签的蛋白，以及其他谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽结合蛋白。GST标签蛋白非变性的条件下被洗脱，保持蛋白质的抗原性和功能。如果想去掉GST标签(一种天然蛋白分子量为26000)，可根据识别特异性位点的蛋白酶进行消化。

• 特异性好、与GST融合蛋白亲和力高，从细菌破碎液中经一步亲和纯化即可得到纯度超过95%的目标蛋白；
  
• 结合在介质上的GST融合蛋白，可被溶液中高浓度的还原型谷胱甘肽(GSH)(33mM)竞争性洗脱。对不同的GST融合蛋白来说，无需摸索最佳的GSH洗脱浓度，使介质的使用更加简单；
  
• GST琼脂糖纯化树脂可再生并反复使用。

GST琼脂糖纯化树脂的特征参数如下：

平均粒径	90μm(45～165μm)
蛋白结合能力	约5～10mg GST标签蛋白/1mL
最大流速	300cm/h
配体密度	10~20 μmol/mL GST树脂
耐压	0.3 MPa,3 bar
储存液	20%乙醇
酸碱稳定性	短期(2h):pH3～12

组分	规格
GST琼脂糖纯化树脂预装柱	10×1mL
Elution Buffer	500mL
Binding/Wash Buffer	500mL

保存：2～8℃，不可冻存

• GST与谷胱甘肽的结合依赖于流速。流量越低，结合能力越强。在上样和洗脱步骤中，流速也是必须要注意的。
  
• 所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

• 下面的方法已成功应用在一些实验室中，其他的确定方法也可能是有效的。
  
• 对于已表达的大肠杆菌沉淀：每克大肠杆菌菌体加入5～10mL Binding Buffer重悬。
  
• 酶解：0.2mg/mL溶菌酶，20μg/mL DNase,1mM MgCl₂，1mM PMSF(终浓度)或其他蛋白酶抑制剂，加入的抑制剂必须对纯化柱没有影响，4℃混匀30min。
  
• 机械裂解：超声、均质、反复冻融等。
  
• 调整裂解液的pH到7.4：不要用强碱或酸调节pH(防止沉淀)。
  
• 裂解液离心：将液体转移到离心管中在室温或4℃ 12000rmp离心20min，温度的选择取决于蛋白的稳定性。
  
• 收集上清准备进行后续实验，或是收集离心后的沉淀准备下一步实验。

• 样品在上柱之前应该离心或是用0.45μm的滤膜过滤后再上柱。如果样品太粘稠，用缓冲液稀释，以防止堵塞。
  
• 对于在酵母、昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸铵进行蛋白沉淀。用1X PBS透析，加入到柱中。在细胞质表达的试剂盒，请用其他试剂或试剂盒，比如一步法昆虫活性蛋白提取试剂盒(货号：GS1535)，一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒(货号：GS1420))，一步法酵母活性蛋白提取试剂盒(货号：GS1423)。或查阅其他的相关文献。

• 分批纯化(孵育法)含GST标签的蛋白：
  纯化的条件可根据实际情况而进行缩放。该方法可以在室温或是4℃条件下进行。
  
  • 加入适量的GST树脂到管中。700×g离心2min并小心的去除上清液。
    
  • 加入10倍柱体积的Binding/Wash Buffer并混匀至树脂完全悬浮。
    
  • 700×g离心2min并小心的去除上清液。
    
  • 对于在昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白[请用其他试剂或试剂盒，例如一步法昆虫活性蛋白提取试剂盒(货号：GS1535)，一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒(货号：GS1420)]或查阅其他的相关文献。然后将提取的蛋白与5倍量的Binding/Wash Buffer混合。其他的Buffer可以使用，但要根据经验确定。
    
    • 对于较多的样品，注意树脂的载量。
  • 将大肠杆菌、昆虫或酵母裂解物与Binding/Wash Buffer混合加入到树脂中平衡柱子并将树脂与液体混匀，在室温或4℃条件下孵育30～60min。
    
  • 700×g离心2min。如需要可保留上清液用作后续分析。
    
  • 加入5～10倍柱体积的Binding/Wash Buffer冲洗树脂。700×g离心2min去上清。如需要可保留上清液用作后续分析。
    
  • 重复清洗步骤，通过测量在280nm吸光度，直到洗出液值达到基线值。
    
  • 用1倍柱体积的Elution Buffer洗脱GST标签蛋白。700×g离心2min小心的留上清。重复此步骤两次，每一次洗脱液分别保存。
    
  • 通过测量在280nm处的馏分的吸光度监测蛋白洗脱情况，洗脱的蛋白可以直接用SDS-PAGE分析。
    
  • 使用3倍柱体积的Binding/Wash Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
• 用重力流穿的方法纯化GST标记蛋白：
  1mL和5mL的预装重力柱的最大的体积分别为10mL和30mL。如果样品的体积大于柱容量，则用多个纯化程序直至样品处理完毕。
  
  • 纯化条件可按需求进行缩放，纯化时在室温或4℃进行操作。
    
  • 将树脂轻轻搅拌几次，使树脂完全悬浮。用移液管将适当体积的树脂浆液转移到重力流柱中。静置待树脂沉降，使储存缓冲液从管中排出。
    
  • 对于在昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白(请用其他试剂或试剂盒，例如一步法昆虫活性蛋白提取试剂盒、一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒)或查阅其他的相关文献。然后将提取的蛋白与5倍量的Binding/Wash Buffer混合。其他的Buffer可以使用，但要根据经验确定。
    
  • 对于较多的样品，注意树脂的载量。
  • 用10倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子。流速为0.5～1mL/min，使缓冲液完全流出或A280达到基线。
    
  • 将大肠杆菌、昆虫或酵母裂解物与Binding/Wash Buffer混合加入到树脂中平衡柱子并将树脂与液体混匀，流速为0.5～1mL/min，将流穿液收集到离心管中用于分析。如有需要，可将流穿液再次加入到树脂中直至树脂达到最大载量。
    
  • 加入5～10倍柱体积的Binding/Wash Buffer冲洗树脂。重复清洗步骤，通过测量在280nm吸光度，直到洗出液值达到基线值，如需要可保留上清液用作后续分析。
    
  • 用2倍柱体积的Elution Buffer洗脱GST标签蛋白。重复清洗步骤，每一次洗脱液分别保存。
    
  • 通过测量在280nm处的馏分的吸光度监测蛋白洗脱情况，洗脱的蛋白可以直接用SDS-PAGE分析。
    
  • 使用3倍柱体积的Binding/Wash Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
    
    • 去除谷胱甘肽可以使用重力型去盐柱(货号：GS1466)。
• 对GST树脂再生修复程序：
  GST树脂可以使用至少五次而不影响蛋白的产量和纯度。执行以下的方法去除残留的谷胱甘肽和任何的非特异性吸附的蛋白质。为了防止样品交叉污染，纯化不同的融合蛋白时需要清洗。
  
  • 加入5倍柱体积的再生Buffer 1(0.1M Tris，0.5M NaCl和0.1% SDS，pH8.5)。
    
  • 加入5倍柱体积的超纯水。
    
  • 加入5倍柱体积的再生Buffer 2(0.1M sodium acetate，0.5M NaCl，0.1% SDS，pH4.5)。
    
  • 加入5倍柱体积的超纯水。
    
  • 用5mL的0.05%叠氮化钠(溶解在水中)冲洗柱子。盖上柱下端和上端的盖子，加入保存缓冲液保存在4℃。
  • 流速是一个影响GST标签蛋白或其他谷胱甘肽结合蛋白连接到GST树脂的重要因素。保持流速降低有利于重组蛋白最大程度的连到树脂上。此外蛋白质本身的性质，pH和温度等因素也可能影响结合能力。
    
  • 洗脱时使用液体的体积和次数根据蛋白的性质而决定。在洗脱时根据需要加入更高浓度的谷胱甘肽。如有必要可对流穿、清洗和洗脱液进行SDS-PAGE并结合Western Blot确定纯化GST标签蛋白的效果。
    
  • GST检验步骤可以用于洗脱时的优化或跟踪GST标签蛋白的纯化。
    
  • 通过测量在280nm处的吸光度可以估算GST标记蛋白的浓度。GST标签可以使用转换近似，A280≈1对应≈0.5mg/mL。
    
  • GST标签蛋白的浓度也可以通过标准显色法测定(如：Lowry法、BCA法和Bradford法)。如果使用Lowry法或BCA法检测，样品必须先用脱盐柱或将样品透析到PBS以去除谷胱甘肽，它可以干扰蛋白质的测定。改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1482)和Bradford法蛋白定量检测试剂盒(货号：GS1481)及改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1483)或抗干扰型蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1485)可直接用于定量，无需去除谷胱甘肽。
    
  • GST树脂的重复使用取决于样品的天然状态以及纯化相同的样品(防止交叉污染)。
    
  • 如果GST树脂几乎已经失去结合能力，这可能是由于沉淀物的堆积、变性或非特异性结合的蛋白质导致的。

GST标签蛋白的去除：
在大多数情况下，与GST连接的蛋白所形成的融和蛋白可保持功能活性。如果想去除GST标签的话，标签蛋白可通过Thrombin识别位点或Xa因子的识别位点去除。可以在蛋白连接到柱上后对位点进行切割，去除GST标签，从而获得靶蛋白或者在洗脱后对GST标签去除。优化切割标签的步骤是必要的，样品可以很容易的在任何时间点被去除，并通过SDS-PAGE的分析去估计产率、纯度以及消化程度。不同的重组蛋白使用的蛋白酶量，温度以及所需完全消化所需的孵育长度不同。对于每个融合蛋白最佳的反应条件应在试验中确定。
Thrombin：
Thrombin分子量：37000 Da。
Thrombin溶解Buffer：PBS，pH7.4。
Thrombin溶液制备：

• 在500μL预冷的PBS中，pH7.4溶解500U Thrombin。
  
• 轻轻旋转溶解。
  
• 分装成80μL并在–80℃冷冻保存。

GST-tagged蛋白连接在树脂上时用Thrombin去除标签：

• 假设：8mg/mL GST标签蛋白结合到树脂
  
• 按照“纯化蛋白”的步骤，不进行洗脱步骤。
  
• 制备Thrombin混合物：为每毫升GST树脂体积，准备混合液，混合液为：80μL的Thrombin(80U)和920μL的PBS，pH7.4(8mg/mL的GST标签蛋白结合树脂)。
  
• 将Thrombin混合物加入到树脂中，封柱。如果批量处理样品，将Thrombin混合物加到树脂中。轻轻摇动或旋转树脂。
  
• 在室温(22～25℃)孵育2~16h。
  
• 孵育后，用大约3倍柱体积的PBS，pH为7.4冲洗柱子。将洗脱液收集在不同管，避免标记蛋白稀释然后分析。如果批处理，将GST树脂悬浮液500×g离心5min，小心地将洗脱液转移到管中。洗脱液将包含目的蛋白和Thrombin，而标签蛋白GST仍然在GST树脂上。

用Thrombin去除洗脱后得到的GST标签蛋白：

• 假设：8mg/mL GST标签蛋白结合到树脂
  
• 每mg洗脱下的标签蛋白加入10μL(10 units)的Thrombin液体。如果GST标签的量未知，每mL蛋白样品加入80μL(80U)的Thrombin液体。
  
• 融合蛋白从GST树脂上被洗脱(8mg/mL GST标签蛋白结合到树脂)。
  
• 在室温(22～25℃)孵育2~16h。
  
• 一旦消化完全，GST可以通过在PBS，pH7.4透析时除去谷胱甘肽时同时被去除。紧接着将样品加入GST树脂中清洗和平衡。
  
• 在室温孵育20～30min。
  
• 通过500×g离心5min的沉淀的介质。上清液包含靶蛋白和Thrombin,，而GST标签仍然在GST树脂上。

问题	可能原因	建议
GST标签蛋白不结合GST纯化树脂	GST标签蛋白被超声后变性	一般超声处理会使GST标签蛋白变性，进而使其不能与GST纯化树脂结合。建议在细胞裂解过程中使用温和的超声条件，并且超声处理条件必须经实验确定是否具有影响。
	细胞裂解和缓冲液中没有预先加入DTT	加入DTT至终浓度为1～10mM，能显着增加一些GST标签蛋白与GST纯化树脂的结合能力。
	pGEX和融合蛋白构象改变	对含有pGEX质粒的细胞进行超声处理，并检查其与树脂的结合能力。如果质粒产生的GST能以高亲和力结合树脂，则融合蛋白可能改变GST的构象，从而降低其亲和性。建议降低结合温度到4℃，减少柱洗涤。
	GST纯化树脂使用前没有平衡	pH小于6.5或者大于8的时候GST标签蛋白不能有效的和GST纯化树脂结合。 检查在细胞裂解液加入前，GST纯化树脂是否用pH=6.5～8.0的缓冲液平衡。
	GST纯化树脂过期	如果GST纯化树脂已经试用多次了，建议换新的GST纯化树脂。
	样品上样流速太快	降低样品上样流速。
GST标签蛋白不能从GST纯化树脂中有效洗脱	洗脱过程中的时间和流速	降低洗脱流速
	洗脱Buffer体积	一般情况下，特别是标签蛋白从纯化树脂上的洗脱过程，洗脱缓冲液越多，洗脱效果越好。
	洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度	本说明书方法中，10mM谷胱甘肽浓度能够适用于大多数GST标签蛋白的洗脱。特殊情况下可以尝试用50mM Tris-HCl，20～40mM还原型谷胱甘肽，pH=8.0的溶液作为洗脱缓冲液。
	洗脱缓冲液中pH	pH过低会限制GST标签蛋白从GST纯化树脂上的洗脱过程。提高洗过缓冲液的pH到8~9，能够不用提高缓冲液中谷胱甘肽的浓度就能提高整体洗脱效果。
	洗脱缓冲液中离子强度	加入0.1~0.2M NaCl到洗脱缓冲液中能够提高洗脱效果。
	洗脱缓冲液中还原型谷胱甘肽没有活性	更换新的洗脱缓冲液(含有有活性的还原型谷胱甘肽)
	洗脱缓冲液中非离子洗涤剂	非特异性的疏水作用会防止GST标签蛋白从GST纯化树脂上溶解和洗脱，加入非离子洗涤剂可以有效避免这种情况，增加洗脱效果。加入0.1%Triton X-100或2% N-octylglucoside可以显着提高一些GST标签蛋白的洗脱效果。
洗脱的目的蛋白在电泳/Western Blotting分析测试中有多个条带。	Mr70000蛋白与GST标签蛋白被共同纯化	Mr70000蛋白质可能是大肠杆菌基因DnaK的蛋白质产物。该蛋白质涉及大肠杆菌中的蛋白质折叠。据研究报道，在给GST纯化树脂上样之前，可以将目的蛋白在50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4，pH7.4，37℃中孵育10min将其破坏。或者通过ATP-琼脂糖和离子交换对标签蛋白纯化来去除DnaK的蛋白质。
	需要更多蛋白酶抑制剂	多个条带可能是由于蛋白酶部分降解了目的标签蛋白的结果。将1mM PMSF加入到裂解溶液中可以改善这种现象。AEBSF是无毒，水溶性的，能够替代PMSF。注意：丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在通过凝血酶或Xa因子切割步骤之前去除。
	使用蛋白酶缺乏的宿主细菌	多个条带可能是宿主细菌中蛋白水解的结果。如果是这种情况，可能需要使用蛋白酶缺乏的宿主细菌(例如lon或ompT)。大肠杆菌BL21具有pGEX载体，是ompT菌株。
	降低超声处理	通过清除悬浮液可以用显微镜清楚观察到细胞破裂。在超声处理之前加入溶菌酶(0.1体积的10mM/mL溶菌酶溶液溶于25mM Tris-HCl，pH8.0)可以改善这种问题。避免起泡，因为这会使融合蛋白变性。过度超声也会导致GST标签蛋白质和宿主蛋白共同纯化。
	需要额外的纯化步骤	多条带可能是由大量蛋白质的共同纯化引起的，这些蛋白质被称为伴侣蛋白，他们参与了大肠杆菌中新生蛋白质的正确折叠。可能有：DnaK(分子量约70000)，DnaJ(分子量约37000)，GrpE(分子量约40000)，GroEL(分子量约57000)和GroES(分子量约10000)。目前已有几种方法报道如何从这些伴侣蛋白中纯化GST标签的蛋白质。
	具有大肠杆菌蛋白的交叉吸附抗体	根据抗GST抗体的来源，它可能含有与各种大肠杆菌蛋白质反应的抗体，在GST标签蛋白样品中显现。
GST标签蛋白切割不完全	GST标签蛋白切割不完全	凝血酶，至少10U/mg标签蛋白。1U凝血酶在22℃下16h内消耗≥90% 100μg的GST标签蛋白。Xa因子是至少1%(w/w)。对于某些标签蛋白，可以使用高达5%的Xa因子，最佳量必须根据实验来确定。某些情况下，1mg/mL的标签蛋白可以得到最佳结果。将约0.5%SDS(w/v)加入到反应缓冲液中可以显着提高Xa因子和一些标签蛋白的切割效果。应测试各种浓度的SDS以找到最佳浓度。
	延长反应时间和酶浓度	对于凝血酶或Xa因子，如果标签蛋白长时间孵育也不被切割，则将反应时间增加到20h或更长。酶的量也可以增加
	验证特定切割位点的存在	检查来源的DNA序列。将其与已知序列进行比较，并验证所用酶不同的特定切割位点在克隆标签蛋白期间未被改变。
	确保不存在切割酶抑制剂	Xa因子：用50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM CaCl2，pH7.4的缓冲液进行透析。Xa因子未被正确激活：功能因子Xa需要激活因子X与罗素的毒蛇毒素。激活条件是罗素的毒蛇毒素与因子Xa的比例为1%，在8mM Tris-HCl，70 mMNaCl，8mM CaCl2，pH=8.0，37℃下孵育5min。Xa因子识别序列的第一个氨基酸是Arg或Pro：检查标记蛋白序列，确保Xa因子识别序列之后的前3个核苷酸不为Arg或Pro。
切割的目的蛋白在电泳分析中有多个条带	确定条带何时出现	测试以确定在凝血酶或因子Xa切割之前不存在另外的条带。这些条带可能是宿主细菌中蛋白水解的结果。
	标签蛋白可能含有预处理蛋白酶，凝血酶或因子Xa的识别序列	检查序列

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